犬呼肠孤病毒感染是由呼肠孤病毒(Rrovirus)引起的一种犬呼吸道传染病，该病毒在分类上属呼肠病毒科，呼肠病毒属。基因组由10个片段的双股RNA组成，经血清中和试验和血凝抑制试验证实，可分为3个血清型.临床表现为发热、咳嗽和上呼吸道炎症，多数情况下，症状较轻，采取合理的对症治疗措施病犬可康复。对于犬呼肠孤病毒感染的病原研究报道较少。2001年我们从表现呼吸道和消化道症状犬的血液和肺组织中分别分离出病毒，能在Vero和MDCK细胞上产生明显的细胞病变。经中和试验和血凝抑制试验初步鉴定为犬呼肠孤病毒1型，为进一步研究犬呼肠孤病毒感染打下基础。现将结果报告如下。 1材料与方法 1.1传代细胞 Vero、FK81、MDCK和BHK-21细胞均由北京京西动物医院保存。DMEM、MEM、1640和小牛血清购自国内试剂公司。呼肠孤病毒抗血清由俄罗斯巴拉扬教授赠送。采集人“O”型、猪和豚鼠血细胞按常规方法处理保存。 1.2病毒分离 无菌采集病犬血5ml，3000rpm离心5分钟。取上清用无血清MEM培基1:1稀释。取2ml分别接种已生长成单层的Vero和MDCK细胞。37℃吸附2小时，然后加入含3%小牛血清的DMEM培养基，置37℃培养，逐日观察细胞病变。 1.3细胞敏感性试验 选用对呼肠孤病毒较为敏感的细胞，如BHK-21、Vero、FK81和MDCK传代细胞进行敏感性试验，观察细胞病变及病变出现的时间，收毒后分别测定血凝效价。 1.4微量细胞中和试验 按文献（1）报道的方法进行。 1.5血凝及血凝抑制试验 参照文献（2）介绍的方法。 1.6电镜观察 收集细胞病变达“+++”—“++++”时的培养物经反复冻化3—4次。取1ml，5000rpm离心10分钟，取上清0.5ml与1:20稀释的兔抗呼肠孤病毒1型血清混合，37℃1小时，置4℃过夜。次日12000rpm离心15分钟。弃上清，适当稀释沉淀物，用磷钨酸染色，电镜观察并拍照。 2结果 2.1病毒分离 血清1:1稀释接种MDCK和Vero细胞，分别第7天和12天出现细胞病变。初期可见细胞单层未见明显脱落现象，传至第3代细胞病变明显提前，所分离的病毒株被命名为BJ-JX-3。 2.2细胞敏感性试验 用MDCK传至3代的病毒培养液分别接种FK81、BHK-21和Hela细胞后，第4天上述细胞出现不同程度的细胞病变，呈胞浆内出现颗粒和空泡，细胞变圆，5-6天后大部分细胞固缩、坏死至到细胞全部脱落。FK81细胞的血凝效价为1:32，BHK-21细胞的血凝效价为1:64，MDCK和Hela细胞血凝效价为1:128。由此可见，FK81、BHK-21、Hela和MDCK对BJ-JX-3株均敏感。其中MDCK和Hela较为敏感，而Vero细胞感染BJ-JX-3后第14天细胞仍不脱落。 2.3血凝和血凝抑制试验 BJ-JX-3株病毒凝集人“O”型血球，效价为1:128-1:256。猪血球血凝效价为1:32-1:64，而不凝集豚鼠的红血球。血凝抑制试验表明抗呼肠孤病毒1-3型血清能抑制BJ-JX-3的只有1型抗血清，而2、3型则无抑制。56℃灭活该病毒，可丧失其血凝活性。 2.4微量中和试验 首先利用MDCK细胞测定BJ-JX-3株病毒的TCID50为4.0，用5个不同稀释度的血清（1:32—1:1024）分别与100TCID50/0.1ml BJ-JX-3病毒作用后，其复合物在MDCK细胞单层上1:32—1:512稀释度时未出现细胞病变，其中和抗体效价可达1:512。 2.5免疫电镜观察 病毒粒子呈圆形，有实心和空心两种粒子，由2层衣壳组成，病毒粒子直径约70-80nm（见图1）。另外在电镜下还发现菌体不规则，呈阿米巴样伪足，多形态成团，可见类似膜样突起（见图2、3），但正常细胞未见到这种多形态的菌体。 3讨论 我国犬群中尚未见有呼肠孤病毒1、2型分离鉴定的报道，Lon（1963）（3），Binn等（1977）（4），Teruaki KOKUBU等（1993）（5）分别从犬体内分离到呼肠孤1-3型病毒，国内沈咏舟等（1999）（6）报道了呼肠孤3型病毒。2001年我们从北京地区患有呼吸道和腹泻症状的病犬血液和犬肺组织中分别分离到呼肠孤病毒。经细胞生物学特性、血凝及血凝抑制试验和中和试验证实为呼肠孤病毒1型。 呼肠孤病毒在犬群中的感染较为多见，该病毒可在多种细胞中增殖，如Vero、FK81、BHK-21和MDCK传代细胞。将病毒接种MDCK细胞，第一代即可出现细胞病变，但培养时间较长，引起的细胞病变缓慢，感染细胞呈颗粒状，细胞不脱落。第一代培养物感染FK81、BHK-21和Vero细胞，病变出现较快（4-7天）。传代次数增多，细胞病变出现的时间越短，MDCK细胞较敏感。 呼肠孤病毒能凝集人“O”型和猪红血球，而不凝集豚鼠红血球，并能被呼肠病毒1型抗血清所抑制。免疫电镜观察呈典型的呼肠孤病毒粒子，故认为BJ-JX-3株属犬呼肠孤病毒1型。在电镜下观察呼肠孤病毒的同时我们还发现伴有支原体感染，说明病犬体内呼肠病毒与支原体混合感染，但在正常细胞中未见支原体存在。 参考文献 （1） 付少才，陈万荣。中国兽医杂志，2001；37（11）：31-32 （2） 殷震，刘景华。动物病毒学[M]第2版，北京：科学出版社，1997；343-350 （3） Lou TY，wennet HA.Am J Hyg，1963；77：293-304 （4） Binn L N，Marchwicki R H .Keenan K P，etal .Am J vet Res .1977；38：927-929 （5） Teruaki KOKUBU，Takuo TAKAHASHI，Keizo TAKAMURA，etal .J Vet Med Sci，1993；55(3)：453-454 （6） 沈咏舟，田克恭，杨汉青等。中国兽医学报，1999；19（5）：445-447