中图分类号：S858.292.53 文献标识码：B 文章编号：0529—6005（2001）11-0031-01 犬细小病毒（Canine Parvirus,CPV）感染是近年来发现的犬的一种烈性传染病，可引起犬出血性肠炎和心肌炎，并使白细胞大量死亡，在幼犬中的发病率和死亡率均很高，目前已成为犬的一种重要传染病，我国亦有本病的暴发流行，并已分离出多株病毒，研究报道日趋增多。目前该病还没有好的治疗方法，只有高价免疫球蛋白在发病早期具有较好效果。为此，我们制备了该病毒的单克隆抗体（Monoclonal antibody,McAb）,从建立的3株CPV McAb细胞株中筛选得株只有中和活性的特异的抗CPV McAb细胞株，并应用于治疗中早期CPV感染犬的初步结果。 1 材料与方法 1.1材料 BALB/c纯系小鼠由中国医学科学院实验动物中心提供，SP2/0骨髓瘤细胞，CPV10-1狗肾细胞培养液，CPV细胞培养抗原片由北京京西动物保健医院提供，细胞融合及杂交瘤筛选常用试剂由各试剂公司购进。 1.2方法 1.2.1免疫动物 取CPV10-1细胞培养液0.5ml与0.5ml福氏完全佐剂混合，制成乳化剂，第1次免疫每只BALB/C小鼠皮下或肌肉注射0.2ml两周后用不完全福氏佐剂第2次免疫，剂量、途径与第1次相同。两周后取血测定效价，效价达1：5000~1：10000以上时供融合用，融合前3天加强免疫1次。 1.2.2抗CPV McAb的制备 取免疫BALB/C小鼠脾脏，制备成脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG1500为融合剂进行融和免疫荧光抗体方法检测融合杂交瘤分泌的McAb。用有限稀释法克隆纯化阳性孔，对阳性克隆克隆化3次，阳性率达100%的扩大培养，留上清，制备腹水，以备鉴定。 1.2.3微量细胞培养中和试验 按常规方法用狗肾细胞系（DK）细胞测定CPVTCID50，然后利用固定病毒稀释血清方法进行微量细胞培养中和试验；用100TCID50的病毒与等量不同稀释后（1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640）的3种腹水分别混合，37C水浴1H。然后每一稀释度的腹水病毒混合物接种96孔DK单层细胞，每孔100ul,每个滴度加3孔，于36.5C 5%CO2培养箱培养，逐日观察细胞病变（CPE）并记录。试验设维持液对照、单纯腹水对照和病毒对照。根据CPE计算50%腹水中和终点，即能保护50%DK细胞不出现CPE的腹水稀释度，按Reed-Muench方法计算McAb的腹水的中和指数。 1.2.4中和交叉试验 首先按常规方法用DK细胞测定CDV、CPV TCID50，然后，分别用上述两种病毒100TCID50的病毒量与稀释CPV-CI McAb进行微量细胞中和交叉试验。 1.2.5实验动物 用150例病犬表现为抑郁、厌食、呕吐腹泻，粪便呈西红柿酱状、腥臭，严重时表现为脱水和体重减轻等症状，用ELISA检测粪便中的抗原呈阳性，临床诊断为CPV感染。治疗时将McAb1：5释释，用0.2um滤膜过滤除菌，病犬按每公斤体重注射0.5—1.0ml股内侧皮下或静脉滴注进行治疗。 2 结果 2.1 CPV杂交瘤细胞株的建立 经过细胞融合，免疫荧光法筛选，将分泌McAb阳性细胞孔连续克隆化3次，使抗体分泌阳性率达到100%。共获得3株能稳定分泌抗CPV McAb杂交瘤细胞，分别命名为C-1、C-2和C-3。经扩大培养后分别制备CPV McAb腹水，利用间接免疫荧光法测定抗体效价，腹水和上清液效价见表1。 表1 3株抗CPV McAb效价 杂交瘤细胞株 免疫荧光 上清液 腹 水 C-1C-2C-3 3．2ⅹ10-21．28ⅹ10-21．28ⅹ10-3 1．6ⅹ10-53．2ⅹ10-41．6ⅹ10-4 2.2微量中和试验 首先利用DK细胞测定CPVTCID50为4.5,DK单层细胞接种后分别在72h和96h出现CPE，依次作为最终判断结果计算TCID50。正常细胞成梭形，铺满培养孔，细胞密集无间隙；病变细胞固缩、破碎、细胞间出现间隙。加McAb腹水对照1：20的稀释度对细胞有轻微的毒性作用。经过3次中和试验测定McAb的中和活性，获得1株McAb（C-1）具有较好中和活性，保护50%DK细胞不产生CPE的McAb腹水的稀释度为1：20、1：40、1：80、1：160、1：320和1：640。稀释320倍时可保护50%DK细胞不产生CPE，而C-2和C-3小于1：20。 2.3中和交叉试验 分别利用CPV、CDV以100TCID50的病毒量与稀释的CPV-CI McAb进行中和交叉试验，结果表明CPV-CI McAb只中和CPV，而与CDV没有交叉反应。 2.4用抗CPV-CI McAb腹水治疗CPV中早期感染犬的初步结果 我们用高价抗CPV-CI McAb对150例病犬进行治疗，136例注射1次和14例注射2次（间隔24h）后病犬症状逐渐减轻，食欲增加，精神状态变好，1周内恢复健康，用ELISA检测粪便中的抗原呈阴性。 3 讨论 利用细胞融合技术，我们制备了能稳定分泌抗CPV的杂交瘤细胞株，建立了免疫荧光细胞化学染色 抗原片快速鉴定McAb感染的方法和利用特异性McAb建立了诊断CPV感染的方法。在此基础上，我们通过微量细胞培养中和交叉试验对抗CPV McAb的中和活性及其在中和反应中的特异性进行了鉴定，筛选出了1株具有中和活性的McAb细胞株。 目前治疗CPV感染的病犬还没有一种特异的治疗方法，临床上多采用对症治疗，效果较差，使用高价免疫血清治疗CPV感染效果较好，我们制备的具有中和活性的抗CPV McAb对病毒感染的针对性治疗具有较好的实用价值，中和McAb所针对的抗原表位通常可以诱导保护作用。在治疗中发现，对中早期CPV感染的病犬股内侧皮下注射治疗效果明显，大剂量静脉滴注效果更佳。150例诊断为CPV感染的病犬经过1~2次治疗后基本痊愈，起到较好的效果。但病犬出现严重脱水、衰竭、心肌炎者治疗效果不理想，有待进一步研究。