犬传染性喉气管炎病毒的分离及鉴定
付少才1，陈万荣2，尚太成1
（1北京京西宠物医院，北京丰台100077）
（ 2 解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，北京100071）
摘要：用犬肾细胞（MDCK）从疑似犬传染性喉气管炎病毒感染犬的急性期血清中分离到1株病毒，经血凝试验、免疫电镜观察、中和试验、免疫荧光抗体试验、细胞培养特征观察和回归动物试验等鉴定，证明所分离的病毒为犬传染性喉气管炎病毒，命名为BJ-JB-3。
关键词：犬传染性喉气管炎病毒；犬肾细胞；分离鉴定
中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：1005-4545（2004）01-0004-02
犬腺病毒（canine adenovirus,CAV）分为2型：犬腺病毒1型（CAV-1），即犬传染性肝炎病毒；犬腺病毒2型（CAV-2），即犬传染性喉气管炎病毒。CAV-2可引起犬的传染性喉气管炎和肠炎。2000年，我们在北京地区从疑似犬传染性喉气管炎病毒感染病犬发病初期的血液中分离到1株病毒，经鉴定为犬传染性喉气管炎病毒，命名为BJ-JB-3。
1 材料与方法
1.1材料 传代细胞有犬肾细胞（MDCK）、猫肾细胞（FK81）和猴肾细胞（Vero），均由北京京霸生物技术开发研究公司传代、培养及保存；抗CAV-2单克隆抗体，购自美国；DMEM、MEM培养基和精制小牛血清，由各试剂公司购进。
1.2病毒分离 无菌抽取病犬血液5mL，离心去除红细胞，血清用不含小牛血清的MEM培养基稀释（1：2），取2mL稀释液分别接种于MDCK、Vero和FK81单层细胞，37C培养4h后弃去接种物，加新配制的营养液继续培养，逐日观察细胞病变（CPE）。
1.3血凝试验 将分离毒在96孔V型微量血凝板上用生理盐水倍比稀释后，再分别加入等体积1%人“O”型以及豚鼠、猪、兔和犬红细胞悬液，振匀，置4C 60~120min后判定结果。
1.4电镜观察 将传至3~4代的病毒反复冻融3次，以5000r/min离心5min，取上清1mL和1：10稀释的抗CAV-2单克隆抗体等量混合，37C1h,置4C过夜，次日以12000r/min离心10min，弃上清，沉淀物用磷钨酸负染和刮取接种病毒的MDCK、VERO和FK81细胞培养物做超薄切片，电镜观察。
1.5免疫荧光抗体试验 将分离毒按常规制成抗原片，用引进的CAV-2荧光抗体染色，在荧光显微镜下观察结果。
1.6中和试验 采用稀释血清固定病毒的方法[1]，在96孔微量细胞培养板中进行，即连续2倍稀释抗CAV-2单抗，稀释到1：1024，每个稀释度以100uL的抗CAV-2单抗与100uL（100TCID50）分离毒株等量混合，振匀，37C作用1h，然后加入50uL/孔约1×10-6MDCK细胞，37C、50%CO2培养箱中静置培养，逐日观察CPE。
1.7回归动物试验 5只2.53月龄幼犬，其中3只人工滴鼻和静脉注射分离毒株2mL，2只留作用对照，逐日观察动物发病情况，并在1周内取血重新分离病毒和解剖，进行脏器的病理观察。
2 结果
2.1病毒分离 将病犬血清接种于MDCK、Vero和FK81传代细胞系中，第9天MDCK细胞开始出现局限性细胞变圆、肿大，随着培养时间的延长，逐步形成“葡萄串”状的特征性病变，严重时细胞脱落，但Vero和FK81细胞维持到第15天后仍未见有上述特征。传至3代时，MDCK细胞病变提前至24~48h，而Vero和FK81细胞仍无CPE，分离毒株在MDCK细胞上的滴度（微量法）为1×10-5。
2.2血凝试验 在4C条件下60~120min，分离毒株可显著地凝集人“O”型红细胞，血凝效价达1：512~1：1024，并能被抗CAV-2单抗所抑制，而对豚鼠、猪、兔和犬的红细胞不发生凝集。
2.3电镜观察 在分离毒株接种第3天，细胞单层约50%出现CPE时制做超薄切片，电镜观察发现，病毒粒子多存在于细胞核内，呈圆型，直径70~80nm，呈典型晶格样排列（图1）；免疫电镜观察到成堆的球型粒子，无囊膜（图2）。
图1 超薄切片观察分离毒在MDCK细胞中增殖，呈晶格样排列×28000
图2 免疫电镜观察实心和空心2种种病毒粒子×73000
2.4免疫荧光抗体试验 经染色后的细胞在荧光显微镜下可见核膜浓染，呈黄绿色荧光。
2.5中和试验 以1：8~1：512的不同稀释度的抗CAV-2单抗与分离毒株中和后，其复合物在MDCK细胞上培养3~5d均未见CPE出现，而对照48h出现CPE。
2.6回归动物试验 用MDCK细胞增殖的第3代培养物，人工给幼犬滴鼻吸入和静脉注射，感染后第3天出现发热(39.539.8C)，并伴有轻咳和流浆液性鼻汁，食欲开始出现不振，饮欲尚可，咳嗽逐步加重。7d以后，咳嗽加剧，并表现出呼吸困难、饮食欲废绝、精神沉郁、肌肉颤抖、流粘液性鼻汁，体温表现低烧或接近常温，肺部可听到广泛性罗音。第13天有1只犬因呼吸窘迫窒息死亡，另2只犬分别于第15天和第21天处死进行解剖。大体病理变化主要表现为，鼻腔和气管有多量粘液性和脓性分泌物，咽喉部粘膜肿胀并有出血点，扁桃体肿大，肺脏膨胀不全，有与正常肺组织界线分明的肝变区，部分肺组织块水中沉底，部分支气管内充积有脓性分泌物和血性物质，肺门淋巴结切开不能合拢，略外翻；消化道部分肠段浆膜有出血点，触摸肠管稍感发硬，肠系膜淋巴结肿胀充血，肠粘膜充血出血，部分粘膜有脱落，大小肠管内有多量血性物质。其他脏器不见有肉眼可见病变。对照犬无以上病变.用人工感染的死亡犬和处死犬的血液和脏器组织接种于MDCK细胞，仍分离出了该病毒。
3 讨论
本试验分离的病毒在MDCK细胞上能良好增殖，第1代即出现CPE，而不能在Vero和81细胞中增
殖，符合文献[2]报道的CAV-2在MDCK细胞上产生的CPE为细胞肿大、变圆，呈“葡萄串”状的特征性病变。
红细胞凝集是犬腺病毒的一个重要特征，利用这一特征可将CAV-1和CAV-2鉴别开来。CAV-1可凝集
人“O”型红细胞和豚鼠红细胞，而CAV-2仅凝集人“O”型红细胞，而不能凝集豚鼠红细胞[3.4]。本试验分离病毒株可凝集人“O”型红细胞，而不凝集豚鼠红细胞。
本试验分离的病毒能被抗CAV-2单抗所抑制。免疫荧光抗体染色试验呈阳性。动物回归试验，试验犬出现了传染性喉气管炎感染的症状以及相应的病理改变，并从感染动物的血液和脏器组织中重新分离到相同的病毒。
综上所述，本试验分离到的病毒是犬传染性喉气管炎病毒，该病毒尚有待于用分子生物学方法做进一步鉴定。
参考文献：
[1] 付少才，陈万荣，抗犬细小病毒单克隆抗体的制备及初步应用[J]. 中国兽医杂志，2001，37（11）：31-32.
[2] 殷 震，刘景华，动物病毒学[M] 北京：科学出版社，1997.1113-1114.
[3] Marusyk R G ,Yamamoto T. Characterization of a canine adenovirus hemagglutinin[J].Can J Microbiol,1971,17(2):151-155.
[4]Murakami T,Kato H, Takada K.Effect of canine adenovirus on JINET and Vero cells[J] .Nippon Juigaku Zasshi,1977,39(2):283-292.
Isolation and Preliminary Identification of Canine Adenovirus Type 2(CAV-2)
FU Shao-cai1,CHEN Wan-rong2,SHANG Tai-cheng3 (1.Beijing Jingba Biological Technology
Company,Beijing 100071,China; 2.Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing
100071,China; 3.Beijing Jingxi Pet Hospital,Beijing 100077,China)
Abstract:The virus was isolated using the MDCKcells from serum of canine suspected to be infected by canine laryngotra-cheitis virus.By neutralization test ,hemagglutination inhibition test and hemocyte agglomeration test ,it was identified as sp rical shape without envelope,a mean diameter of 70-80 nm.
Key words:canine infectious laryngotracheitis;MDCK cells;identification and isolation
