犬瘟热是由犬瘟热病毒（Canine Distemper Virus,CDV）引起的一种急性传染性极强的病毒，在幼犬中本病的死亡率较任何其他传染病为高。犬瘟热一直是近几年来发病率最高、死亡率最多、危害最为严重的犬传染病之一，根据报道[1]动物医院门诊就诊率比其他传染病高。犬瘟热也是水貂的一种传染病，又称貂瘟，死亡率也很高，引起严重的经济损失。该病毒属副粘病毒科、麻疹病毒属，是一种非重叠的负链RNA，由15616个核苷酸组成。目前对该病度的检测方法有ELISA荧光试验法和血凝试验法等，但用基因诊断方法诊断CDV感染国内报道甚少，我们建立了从病犬粪便、血液和体外细胞培养标本中提取RNA，用RT-PCR方法扩增到产物，并进行了部分基因序列测定，现将实验报告如下。 1 材料和方法 1.1材料来源 血清、粪便标本采自北京京西动物医院门诊病犬，根据临床表现和ELISA方法诊断为犬瘟热病毒感染，体外细胞培养标本经反复冻融3次，3000rpm/5分钟取上清液-80゜C备用。T载体为PGEM，反转录酶（AMV），Taq酶，dNTps及T4DNA连接酶购自华美公司。PCR引物由上海博亚公司合成并进行序列测定。 1.2引物设计及PCR扩增条件 引物设计参考文献[2]CDV-OND株的序列，P1引物为：5’ACA GGA TTG CTG AGG ACC TAT 3’,P2引物为：3’CAA GAT AAC CAT GTA CGG TGC 5’。 1.3CDV RNA 提取 取血清、粪便悬液和CDV细胞培养液100ul加入到0.5ml离心管内，加入120ul变性液，振荡1分钟，85゜C加热10分钟，冷却后13000rpm/5分钟离心取上清100ul至新的离心管中，再加入75 ul异丙醇，振荡均匀，室温或-20゜C放置沉淀1小时或过夜。13000rpm/10分钟离心，吸去上清，加入300 ul -400ul预冷的65%乙醇，轻轻振荡混匀，室温13000转离心5分钟，吸取上清，室温放置10分钟凉干，在离心管内加入15 ul无菌水，90゜C加热5分钟振荡混匀，室温13000rpm/5分钟离心，保存用于PCR扩增。 1.4CDV RNA 反转录 各取提取的CDV RNA 1ul每个管内加入5xPT Buffer 4ul,25mMdNTP 0.1ul,AMV 0.6ul,Rnasine (40%)0.5ul,无菌高纯水15ul，总量为20ul，然后42C1小时，每个样品取8ul进行PCR扩增。 1.5 cDNA PCR扩增 扩增条件：各取8ul cDNA作模板，3ul 10xPCR缓冲液，引物浓度为.01umol/L 、dNTPs 0.08umol/L、 Taq酶每个样品用2个单位，反应体积为30 ul，94゜C预变性180秒，94゜C35秒，72゜C40秒，55゜C35秒，72゜C延伸5-10分钟，扩增35个循环，用1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察PCR扩增带。 1.6 PCR产物的克隆测序 扩增出阳性的PCR产物，直接于PGEM-T载体连接，转化XL1-Blue宿主菌，挑取白色菌落用PCR鉴定，对阳性菌落接种培养，提取质粒DNA，单链测序。 2 结果 2.1 RT-PCR扩增 根据文献报道[2]已知CDV-OND部分序列，合成一对引物，分别对病犬血清、粪便和细胞培养分离标本进行RNA提取，经RT-PCR扩增对其产物进行电泳分析，分别在287bp部位出现一条带，而正常粪便、血清和细胞培养液未见带（图1）。 2PCR产物的测定 对细胞培养分离标本的PCR扩增产物，经pGEM-T载体连接、转化和克隆后测定了该片段的序列，该序列与文献报道的CDV-OND株和CDV-Rock株对应位置的核苷酸和氨基酸同源性为96%-97%（图2） 3 讨论 犬瘟热病毒的RT-PCR研究国外文献报道的较多，国内文献较少，1999年FRISK，A.L.等报道了用RT-PCR方法，从病犬的血清、全血和脑积液中分别扩增到CDV基因，并进行了部分序列测定，表明具有较好的敏感性和特异性。我们按文献的方法合成一对引物，用RT-PCR方法，从病犬粪便、血清和细胞培养分离株中分别扩增到287片段的基因，并用细胞培养分离株的扩增产物连接在pGEM-T载体上进行序列测定，该株病毒与文献报道的标准株比较，其核苷酸和氨基酸的同源性分别在96%和97%以上，这表明我们用细胞培养从病犬血液中分离的病毒为CDV。 我们建立的RT-PCR方法是特异的敏感的，这一方法的建立可应用于CDV基因诊断、分析强毒株和弱毒株之间的基因差异，研究CDV在国内是否存在着不同的地理株和不同地区CDV的变异以及研制亚单位疫苗和基因工程重组活疫苗打下基础。