付少才1，陈万荣2，刘树玲2
（1、 北京京西动物医院，北京丰台100077）
（2、北京军事医学科学院微生物流行病研究所，北京丰台100071）
目前，犬温热（CD）还没有很好的治疗方法，但认为高效价免疫球蛋白在发病早期具有较好疗效。为此，本研究制备了该病毒的单克隆抗体（McAb），从建立的4株抗犬瘟热病毒（CDV）McAb细胞株中，用微量细胞中和试验筛选得到了2株具有中和活性的特异抗CDV McAb细胞株，并应用于治疗中早期CDV感染犬。
1 材料与方法
1.1 材料 BALB/c纯系小鼠，由中国医学科学院实验动物中心提供；SP2/0骨髓瘤细胞，由军事医学科学院微生物流行病研究所提供；CDV 10-1犬肾细胞培养液、CDV细胞培养抗原片，自制；细胞融合及杂交瘤筛选常用试剂，市购。
1.2动物免疫 取10-1CDV细胞培养液0.5mL与0.5mL福氏完全佐剂混合，制成乳化剂。第1次免疫给BALB/c小鼠皮下或肌肉注射化剂（0.2mL/只），2周后用不完全福氏佐剂第2次免疫，剂量、途径与第1次相同。2周后采血测定效价，效价达1：5000~1：10000以上时供融合用。融合前3D加强免疫1次。
1.3抗CDV McAb的制备 取免疫BALB/c小鼠脾脏制备成脾细胞，以PEG1500为融合剂与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，用免疫荧光抗体法检测融合杂交瘤分泌的McAb。用有限稀释法克隆纯化阳性孔（1），对阳性孔克隆化3次，阳性率达100%的扩大培养，留上清，制备腹水，以备鉴定。
1.4微量细胞培养中和试验 按常规方法用犬肾细胞系（DK）细胞测定CDV TCID50，然后利用固定病毒稀释血清法进行微量细胞培养中和试验。用100TCID50的病毒与等量不同稀释度（1：8，1：16，1：32，1：62，1：128，1：256）的4种腹水分别混合，37C水浴1h。然后将每一稀释度的腹水病毒混合物接种96孔DK单层细胞，每孔100ul,每个滴度加3孔，于37C、5%CO2培养箱培养，逐日观察细胞病变（CPE）并记录。试验设维持液对照、单纯腹水对照和病毒对照。根据CPE计算50%腹水中和终点，即能保护50%DK细胞不出现CPE的腹水稀释度，按Reed-Muench方法计算McAb腹水的中和指数（2）。
1.5中和交叉试验 首先按常规方法用DK细胞测定CDV、犬细小病毒（CPV）的TCID50，然后分别用上述2种病毒100TCID50与稀释的抗CDV McAb（A-1、A-2）进行微量细胞中和交叉试验。
1.6治疗试验 病犬100例，临床表现为体温升高（39.7~41C）多数病例表现为上呼吸道感染症状，食欲减退，倦怠，眼鼻流水样分泌物，此后转变为粘液性浓性分泌物，随后出现支气管炎、卡他性肺炎，严重时出现胃肠炎和神经系统症状。用ELISA检测粪便中的抗原呈阳性，临床诊断为CDV感染。治疗时，将McAb 1：1稀释，用0.2um的微孔滤膜过滤除菌，病犬按0.51.0mL/kg于股内侧皮下注射或静脉滴注进行治疗。
2 结果
2.1 CDV杂交瘤细胞株的建立 经过细胞融合，免疫荧光法筛选，将分泌McAb阳性细胞孔连续克隆3次，使抗体分泌阳性率达到100%，共获得4株能稳定分泌抗CDV McAb杂交瘤细胞，分别命名为A-1、A-2、A-3和A-4。经扩大培养后，分别制备抗CDV McAb腹水，利用间接免疫荧光法测定抗体效价，腹水和培养上清液效价见表1。
表1 间接免疫荧光法测定抗体效价结果
杂交瘤细胞株 抗CDV McAb效价
培养上清液 腹水
A- 1A- 2A - 3A- 4 3．2ⅹ10-23．2ⅹ10-21．28ⅹ10-31．28ⅹ10-3 1．6ⅹ10-63．2ⅹ10-41．6ⅹ10-41．6ⅹ10-4
2.2微量中和试验 利用DK细胞测定CDV TCID50为5.5，DK单层细胞接种后分别在72、96H出现，依次作为最终判断结果计算TCID50，正常细胞培养孔，细胞密集无间隙；病变细胞圆缩、破碎，细胞间出现间隙。加McAb腹水对照（稀释度1：8）对细胞有轻微的毒性作用。经过3次中和试验测定McAb的中和活性，获得2株McAb（A-1、A-2）具有较好中和活性，保护50%DK细胞不产生CPE的McAb腹水的稀释度为1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、和1：256。A-1稀释120倍，A-2稀释32倍时可保护50%DK细胞不产生CPE，而A-3和A-4小于1：16。
2.3中和交叉试验 A-1、A-2 McAb只中和CDV，而与CPV没有交叉反应。
2.4治疗试验 用抗CDV McAb（A-1）对100例病犬进行治疗，56例注射2次和44例注射3次（间隔24h）后，病犬症状逐步减轻，食欲增加，精神状态变好，1~2周内恢复健康，用ELISA检测粪便中的抗原呈阴性。
3讨论
利用细胞融合技术制备了能稳定分泌抗CDV的杂交瘤细胞株，建立了免疫荧光细胞化学染色抗原片快速鉴定McAb建立了ELISA诊断CDV感染的方法。在此基础上，又通过微量细胞培养中和交叉试验对抗CDV McAb的中和活性及其在中和反应中的特异性进行了鉴定，筛选出了2株具有中和活性的McAb细胞株。
目前对CDV感染的病犬还没有一种特异的治疗方法，临床上多采用对症治疗，效果较差；而使用高效价免疫血清治疗CDV感染的效果较好。我们制备的具有中和活性的抗CDV McAb对病毒感染的针对性治疗具有较好的实用价值，中和McAb所针对的抗原表位通常可以诱导保护作用（3）。在治疗中发现，对中早期CDV感染的病犬股内侧皮下注射治疗效果明显，大剂量静脉滴注效果更佳。100例诊断为CDV感染的病犬经过2~3次治疗后基本痊愈，如果病犬出现严重的神经系统症状、脱水和衰竭时，治疗效果则不佳。这可能是筛选的抗CDV McAb中和活性滴度不高，不能中和体内大量的病毒。
参考文献：
[1] 徐志凯. 实用单克隆抗体技术[M]. 西安：陕西科学技术出版社，1992.66-68.
[2] Reed L J,Muench H.A simple method of estimating fifty percent endpoints[J].Am J Hyg,1938,27:493.
[3] Bolwyll C,Clarke B E ,Parry N R,et al.Epitope mapping of foot-and-mouth disease virus with neutralizing monoclonal antibodies[J].J Gen Virol,1989,70(1):59.
Prdparation and Application of Mouse Anti-CDV Monoclonal Antibodies
FU Shao-cai 1, CHEN Wan-rong 2, LIU Shu-ling 3 (1.Hospital of Jingxi Animal Hygiene,Beijing 100071 ,China 2.Beijing Institute of Mirobiology & Epidemiology,Beijing 100071,China;)
Abstract:Monoclonal antibodies(McAb) against canine distemper virus(CDV) were produced by fusing SP2/0 myeloma cells with spleen cells from BALB/c mice immunized with CDV .Four hybridoma cell lines secreting specific antibodies against CDV were obtained by screening hybridoma culture supernatants with indirect immnofluorescence assay.All lf McAb were IgG1.Their titre in culture supernatants and ascitic fluids ranged from 3.2×10-2to 1.28×10-3and 3.2×10-4to 1.61×0-5respectively.Two of McAbs(A-1,A-2)were found have neutralizing activity against CDV ivfection and could protect 50% cells from pathological changes even it was diluted 32 or 128 times. Good result was obtained when CDV A-1 was used to treat 100CDV infected canines.
Key words:canine distemper virus;McAb;immunofluorescence assay;treatment
